Научный руководитель: Кудряшева Надежда Степановна, к.ф.-м.н.

Применение ингибиторов для изучения клетки или ферментативных систем клеток является одним из путей изучения природы живой материи и ее превращений. Сущность такого метода исследования состоит в нарушении нормальной деятельности сложной системы действием ингибиторов таким образом, чтобы можно было понять природу этой системы в ее исходном нормальном состоянии. С другой стороны, полное знание механизмов функционирования ферментативных систем и их сопряжения позволит решать обратные задачи, которые находят широкое применение при создании ферментативных биотестов для экологического мониторинга. Т.е. по изменениям кинетических параметров ферментативных систем в присутствии экзогенных соединений определить возможные механизмы их действия, и в первом приближении идентифицировать принадлежность токсиканта к тому или иному химическому классу веществ.

Для интерпретации результатов биолюминесцентного анализа необходима классификация ингибиторов и выявление специфичности действия отдельных групп химических веществ на биолюминесцентные системы. Как было показано ранее, во многих случаях классическая классификация ингибиторов Ментена не позволяет классифицировать экзогенные соединения при воздействии на биолюминесцентную реакцию. Причина этого – во множестве путей воздействия большинства соединений на биолюминесцентную систему. Отклик биологических систем на влияние экзогенных веществ является интегральным, он зависит сложным образом от природы этих веществ. С точки зрения молекулярной биофизики, выходом из сложившейся ситуации может быть новая классификация ингибиторов и активаторов биолюминесценции на основе изучения их влияния на элементарные физико-химические процессы переноса (энергии, водорода (e^- + H⁺)) в биолюминесцентной системе. При этом должны быть установлены корреляции между физико-химическими характеристиками молекул-ингибиторов (активаторов) и изменением кинетических параметров биолюминесцентной реакции. Такие корреляции тесно связаны с физическим механизмом биолюминесценции и представляют собой биофизическую основу биолюминесцентного экологического мониторинга.

Воздействие экзогенных молекул на биолюминеценцию, характерное для всех люминесцетных систем, заключается в возможности протекания процессов переноса энергии биолюминесценции на электронно-возбужденные состояния молекул-тушителей. Для оценки вероятности акцкптирования энергии с низшего возбужденного синглетного состояния эмиттера биолюминесценции молекулами исследуемых веществ были оценены относительные площади перекрывания спектров поглощения хинонов со спектром биолюминесценции. Было показано, что большей площадью перекрытия и, следовательно, большей вероятностью акцептирования энергии биолюминесценции характеризуется 1,4-нафтохинон и минимальной 9,10-антрахинон. Сравнение площадей перекрытия спектров с кинетическими параметрами биолюминесценции не показало корреляции между этими величинами, на основании чего сделали вывод о том, что данный процесс ингибирования не является определяющим для исследуемых соединений.

Другой путь воздействия связан с влиянием хинонов на редокс процесс, протекающий в биолюминесцентной системе с участием НАДН: ФМН - оксидоредуктазы. Как было показано ранее, для ряда хинонов характерно специфичное влияние на кинетику биферментной системы, что выражается в появлении индукционного периода и времени задержки выхода на максимум свечения. Данные эффекты связаны с возможностью протекания конкурентных отношений хинона и ФМН в реакции восстановления. В результате работы установлена связь констант ингибирования, времени выхода на максимум, индукционного периода биолюминесценции биферментной системы со стандартными редокс потенциалами хинонов. Наибольшей ингибирующей способностью характеризуется 1,4-бензохинон (Е⁰=0,712 В), в то время как 9,10-антрахинон, обладающий наименьшим стандартным редокс потенциалом (Е⁰=0,156 В) оказывает меньшее влияние на биолюминесценцию. Методом абсорбционной спектроскопии показано конкурентное ингибирование ферментативного восстановления ФМН молекулами хинонов. Установлена возможность ферментативного восстановления хинонов с участием НАДН: ФМН - оксидоредуктазы. В результате анализа кинетических и термодинамических характеристик ферментативных и не ферментативных реакций восстановления хинонов и ФМН показана роль метиловой группы при связывании субстратов с оксидоредуктазой.