Научный руководитель: Воробьёв Владимир Иосифович, Доктор биологических наук
Соавторы: Чихиржина Елена Всеволодовна, Скворцов Алексей Николаевич

Как известно, конформация ДНК в растворе зависит от состава и качества растворителя. В условиях обычного физиологического раствора in vitro ДНК находится в состоянии т.н. В-формы. Одним из наиболее чувствительных к изменениям конформации полимеров методом является круговой дихроизм (КД). Спектр КД такой ДНК в области 200-300 нм представляет собой две пары симметричных пиков. Внутри каждой пары есть положительная и отрицательная полосы, ограничивающие равные площади. Помимо В-формы ДНК, широко известна т.н. А-форма. Она также как и В-форма представляет собой левую спираль, но с совершенно другими спиральными параметрами. Меняется при этом и сам характер укладки пар оснований в двойной спирали. Соответствующий ей спектр КД существенно отличается от описанного выше: обширная отрицательная полоса в области 240-250 нм уменьшает свою интенсивность, в то время как интенсивность парной ей положительной полосы в области 270 нм заметно возрастает. При этом наблюдается некоторый сдвиг её максимума в коротковолновую область. Такой конформационный переход можно наблюдать, поместив ДНК в раствор этилового спирта. При концентрации этанола порядка 70% наблюдается достаточно резкий переход от В- к А-форме. Характерно, что при этом интенсивность второй (“минорной”) пары пиков остается практически неизменной.

Помимо этилового спирта для изучения подобных конформационных переходов в ДНК достаточно давно в качестве растворителя используется трифторэтанол (ТФЭ). В целом ряде работ были проведены эксперименты по изучению влияния ТФЭ на структуру ДНК. Отмечено, что данный растворитель является более удобным в работе, так как в значительно меньшей степени способствует высаживанию ДНК. На основании анализа спектров КД таких систем в области 230-300 нм был сделан вывод о переходе ДНК в близкую к А-форме конформацию, что позволило использовать данную систему как модельную при изучении А-формы ДНК. Однако проведённые нами эксперименты показали, что в области 200-230 нм (в области “минорных” полос) наблюдаются существенные отличия в спектрах ДНК в этаноле и трифторэтаноле. В последнем случае мы наблюдаем сильнейший рост интенсивности отрицательной полосы в окрестности 210 нм, который по абсолютному значению становится сравнимым с положительной полосой в области 270 нм. Это обстоятельство представляется нам весьма важным и свидетельствует о том, что структура ДНК в ТФЭ не тождественна А-форме. Эти данные отчасти согласуются с данными других авторов, в работах которых было показано, что говорить о близости к А-форме можно только в случае последовательностей ДНК, предрасположенных к образованию А-ДНК.

Другим доводом в пользу нашей гипотезы может служить необычное влияние соли на конформацию двойной спирали в ТФЭ. В тех случаях, когда в растворе присутствовал NaCl, мы наблюдали резкий переход от спектра, описанного выше, к спектру более всего напоминающему спектр y -формы. Переход происходил при высоких концентрациях ТФЭ в растворе, однако точка перехода зависела от концентрации соли: чем больше ионная сила раствора, тем при меньших концентрациях ТФЭ фиксировали изменения в спектре. Ничего похожего для случая этанола нам наблюдать не удалось. Спектр такого вида предполагает образование упорядоченных структур и/или конденсацию полимера. Как и в случае y -формы эффект носит ярко выраженную зависимость не только от концентрации соли, но и от концентрации самой ДНК: при больших концентрациях ДНК требуется меньшее содержание ТФЭ. Однако принципиальным отличием от psi-формы является отсутствие второго полимера, что заставляет предположить обусловленность эффекта исключительно действием растворителя. Таким образом мы видим, что действие ТФЭ само по себе может приводить к образованию компактных упорядоченных структур.

Однако широко известен и другой путь упорядочения и компактизации ДНК: формирование ДНК-белкоых комплексов. Так примером образования классической y -формы ДНК может служить взаимодействие ДНК с гистоном Н1 в растворах высокой ионной силы. Примером же компактизации ДНК без участия соли является взаимодействие ДНК с негистоновым хромосомным белком HMG1. Ранее в нашей лаборатории было показано, что взаимодействие этого белка с плазмидной ДНК ведёт к формированию компактных комплексов, способных при определённых условиях осуществлять трансфекцию чужеродного генетического материала в клетки млекопитающих. Молекула белка HMG1 имеет ярко выраженную доменную структуру и состоит их трёх основных элементов. Двух близких по структуре и функциям фрагментов, называемых HMG-доменами А и В, и неупорядоченного хвостового участка, образованного непрерывной последовательностью из 30 дикарбоновых кислот. Имея достаточно жесткую и консервативную структуру, HMG-домены обеспечивают взаимодействие белка в целом с ДНК. Некоторыми исследователями было показано, что отсутствие кислого хвостового участка (оставшийся фрагмент из двух HMG1-доменов носит название HMG3) ведёт к усилению ДНК-белкового взаимодействия. Нами были проведены иследования структурных изменений в комплексе HMG1(А+В)-ДНК методом кругового дихроизма. Сравнение полученных спектров с результатами ранее проведённых измерений для системы HMG1-ДНК показало качественно иную картину комплексообразования. Если в случае HMG1 мы наблюдали основные изменения в белковой части спектра, т.е. проявление изменений в структуре белка, либо же белок-белковые взаимодействия, то в случае с HMG1-(А+В) мы получили гигантский (в десятки раз) рост интенсивности ДНК-овой полосы в области 270 нм. Несмотря на то, что вид данного спектра подобен спектру А-формы ДНК, вероятнее всего рост интенсивности положительной полосы обусловлен конденсацией и/или компактизацией ДНК в комплексе, т.е. имеет механизмы образования близкие к y -форме, в которых важная роль принадлежит ДНК-белковым и белок-белковым взаимодействиям